克罗诺杆菌的简介
克罗诺杆菌（Cronobacter）是一种革兰氏阴性的无芽孢短小杆菌，属于肠杆菌科，是一种兼性厌氧的条件性致病菌。在显微镜下呈球杆状或成对排列，有时也可呈短链状，大小为（0.6μm-1.1μm）×（1.2μm-3.0μm），周身鞭毛，有动力，广泛分布于婴幼儿配方粉、奶粉、奶酪、水果、蔬菜、肉制品以及自然环境中。
克罗诺杆菌曾被认为是产黄色素的阴沟肠杆菌，1980年法默等通过不同菌株之间的DNA杂交、生化、血清等特性，将其正式更名为阪崎肠杆菌，2008年又重新将其定义为克罗诺杆菌属。该菌属共包括7个种和3个亚种，即阪崎克罗诺杆菌、苏黎世克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌（含有3个亚种：都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种、都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种、都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种）、穆汀斯克克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、康迪蒙提克罗诺杆菌和尤尼沃斯克罗诺杆菌。模式种为阪崎克罗诺杆菌，模式菌株为ATCC 29544。
克罗诺杆菌的检验标准的更新
在2024年2月8日颁布的GB 4789.40-2024版本中，在适用范围中增加了婴幼儿辅助食品，即新标准适用于婴幼儿配方食品、 婴幼儿辅助食品、 乳及乳制品及其原料中克罗诺杆菌的检验。
（图片来源于GB4789.40-2024）
克罗诺杆菌定性检验
1. 前增菌和增菌
取检样100 g(mL) 置无菌容器中, 加入900 mL 已预热至41℃±1℃ 的缓冲蛋白胨水用手缓缓地摇动至充分溶解,36 ℃ ±1 ℃ 培养18 h±2 h。移取1 mL 转种于10 mL mLST-Vm 肉汤，41.5℃±1℃培养24 h±2 h。
由于取样量较大，如用到剪刀勺子等工具，需提前高压灭菌，也可以使用无菌的大均质袋来进行前增菌，便于节省空间。培养时，需防止均质袋翻倒造成液体溢洒及封口不当发生污染。
BPW预热至41℃±1℃有助于粉状样品充分溶解，也避免了因液体较多升温较慢引起的增菌失败。必要时，可拍打均质袋使粉状样品充分溶解混匀，BPW相较于无菌生理盐水等能更好地使受损或缺乏营养的细菌恢复生长。
BPW
克罗诺杆菌属具有较强的耐渗透压能力和较好的耐热性，且对万古霉素天然耐药，因此使用的改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST-Vm）肉汤在提供了良好营养的条件下利用高浓度的氯化钠和万古霉素，且在41.5℃±1℃培养，能有效的抑制革兰氏阳性菌和其他不耐渗透压、不耐热的细菌生长。之前2016版标准中44℃的选择性增菌温度，是因为该温度与ISO 22964-2006相同，但目前国际普遍认为该温度可能抑制部分受损伤的克罗诺杆菌生长，容易导致污染样品发生漏检。 因此ISO 22964-2017已将选择性增菌温度由44 ℃±0.5 ℃修改为41.5 ℃±1 ℃，2024版的新标准也进行了相应的调整。
mLST-Vm
（图片来源于GB4789.28-2024）
2. 分离
轻轻混匀 mLST-Vm 肉汤培养物, 各取增菌培养物1 环, 分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板, 36 ℃ ±1 ℃ 培养24 h±2 h, 或按商品化培养基的要求条件进行培养。
显色培养基
目前北京陆桥有三款适用于克罗诺杆菌检验的显色培养基。由于标准未规定产品配方，客户可根据需求任选其一。
ESM015 克罗诺杆菌显色培养基（DFI）：样品干扰菌少时可选择。
ESM016 克罗诺杆菌显色培养基：对样品中的干扰菌有更好的选择性和分辨性。
ESM020 克罗诺杆菌显色培养基（CCI）：ISO22964-2017标准中CCI琼脂。
ATCC 29544阪崎克罗诺杆菌在三种培养基上的生长情况
样品分离干扰菌在三种培养基上的生长情况
注：CCI在实际表现中与DFI相近
每个平板挑取至少5 个可疑菌落, 不足5个时挑取全部可疑菌落, 划线接种于 TSA 平板。36 ℃ ±1 ℃培养24 h±2 h。
有文献报道和相关检测中发现，部分克罗诺杆菌不产黄色素，因此在新标准中，删除了黄色素的生化鉴定项目。
3.鉴定
自TSA平板上直接挑取可疑菌落, 进行生化鉴定。克罗诺杆菌属的主要生化特征见标准中的表3。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。新标准中，删除了苦杏仁苷生化项目。
（图片来源于GB4789.40-2024）
4. 分子生物学检测
随着乳制品生产企业和相关监管部门对检测方法时效性和准确性需求的日益迫切，传统的检测方法虽然准确可靠，但操作繁琐、工作量大、耗时较长，已不能满足快检的要求。而分子生物学的检测方法，由于其具有特异性强、准确性高且快速的优势，近年来被逐渐引入到食品微生物的检测标准（例如GB 4789.6-2016）中。SN/T 1632.3-2013出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法中就有关于克罗诺杆菌荧光PCR的检测方法。在新的克罗诺杆菌检测标准中也增加了PCR鉴定的方法，将其作为选做内容。
北京陆桥的MX-1301克罗诺杆菌属核酸检测试剂盒，采用荧光PCR的检测技术，对克罗诺杆菌属的特异性基因进行检测，且含有内标基因，只根据其扩增曲线即可进行判定，简便快捷，可根据需求进行菌液或菌落的鉴定，极大的丰富了克罗诺杆菌的鉴定手段。
克罗诺杆菌属核酸检测试剂盒及阪崎克罗诺杆菌荧光PCR结果图
5.结果与报告
综合菌落形态、生化鉴定或PCR鉴定结果, 报告每100 g(mL) 样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。
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