2025年3月16日颁布的GB 4789.38－2025《食品安全国家标准　食品微生物学检验　大肠埃希氏菌计数》将于9月16日正式实施。新标准对范围、检验原理、设备和材料、培养基和试剂、检验程序、操作步骤、结果与报告多个方面都进行了规定。由于文本内容较多，我们不再一一赘述。现将其重大变化总结如下：

重大变化1：MPN法中增加了贝类及产品的接种方法以及MPN表

由于牡蛎等双壳贝类本身产生β-葡萄糖醛酸苷酶，所以更适用于MPN法进行检测。在国际标准ISO 16649.3-2015以及FDA BAM中对双壳贝类产品均采用每个稀释度接种5管，接种3个连续稀释度共15管的方法。为了满足出口需要，新标准中增加了5管接种方法，还将需要采用5管接种的范围扩大为全部贝类及产品。

重大变化2：MPN法中TBX琼脂取代了EMB及后续的生化试验

从MPN法流程来看，简化了操作步骤不再进行生化确认，意味着大大缩短了检测时间。可能大家会有疑问：取消生化鉴定会不会影响结果的准确性呢？我们从两方面进行解答：

1）EMB本身为弱选择性培养基，特异性较差。再加上后续的生化实验，操作步骤比较繁琐。

2）TBX是利用大肠埃希氏菌所产生的β-葡萄糖醛酸苷酶，与培养基中显色底物反应，使菌落着色来区分大肠埃希氏菌和其他非目标菌。

标准制修订专家在标准宣贯时也提到TBX的特异性远远高于EMB，同时β-葡萄糖醛酸苷酶的准确度也明显高于生化鉴定IMViC。

重大变化3：平板计数法中TBX琼脂取代了VRBA和VRBA-MUG

如果说MPN法中TBX琼脂的引入提高了时效，那么平板计数法又为何用TBX琼脂来取代同样无需生化确认的VRBA-MUG呢？我们要从VRBA-MUG的反应原理说起，VRBA-MUG同样是利用大肠埃希氏菌所产生的β-葡萄糖醛酸苷酶，不同的是培养基中的底物为4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷（MUG）。大肠埃希氏菌能够分解培养基中的MUG，使4-甲基伞形酮游离出来，在长波紫外光下产生蓝色荧光。因为菌落计数依赖于荧光的观察，所以实际操作时可能会遇到一些问题。

1）紫外灯：观察荧光需要合适的紫外灯，不同紫外灯下观察到的荧光有明显差异。所以配置时需要关注波长、功率等。

两台不同紫外灯观察到的荧光强弱有差异

2）计数：4-甲基伞形酮具有水溶性，即使在标准规定的适宜菌落数的平板上，荧光扩散很容易将非目标菌也染上荧光，造成计数困难。

    不同目标菌数量时显现的荧光情况

3）假阴性：2012版标准接种方式为先倾注VRBA再覆盖VRBA-MUG，不能直接接触到VRBA-MUG的目标菌荧光不明显，可能导致假阴性。

4）试验器皿的干扰：要求材质良好且洁净无残留。因为某些器皿材质本身含有荧光物质，或者清洗时残留的洗涤剂也可能会有荧光，容易造成假阳性结果。

5）标准菌株对照：操作时要求使用阳性目标菌和阴性菌作为对照，以保证结果的有效性。

综上所述，VRBA-MUG在实际应用中存在诸多难点，而TBX琼脂具有良好的特异性，单纯从菌落颜色来进行判定，不仅无需配置特定设备，而且观察简单明了，也减少了判读误差。

TBX琼脂是胰蛋白胨胆盐 X-葡萄糖醛酸苷（TBX）琼脂的简称，原理是利用大肠埃希氏菌所产生特异性的β-葡萄糖醛酸苷酶，分解TBX琼脂中的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷底物，形成蓝绿色菌落，从而区分目标菌和其他菌。

--注：绝大多数大肠埃希氏菌具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。但大肠埃希氏菌 O157等菌株没有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。另外，肠杆菌科内一些志贺氏菌、沙门氏菌等菌株也具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。

接着看看分别用标准菌株验证目标菌回收率、非目标菌特异性及选择性，以及使用样品添加、质控样品及自然污染样品验证其实际应用的结果。

1）标准菌株试验：不同菌株生长情况如表1所示。

--大肠埃希氏菌在TBX琼脂上菌落形态为蓝绿色且菌落中心颜色深，回收率PR均大于0.7（质控依据参照VRBA琼脂）；

--大肠埃希氏菌O157由于不产生β-葡萄糖醛酸苷酶，则表现为无色菌落；

--多数非大肠埃希氏菌的肠杆菌科细菌呈现无色菌落；

--铜绿假单胞菌由于可产生蓝绿色素，呈现绿色扩散菌落，可以与大肠埃希氏菌进行区分；

--沙门氏菌中亚利桑那沙门因具有β-葡萄糖醛酸苷酶的活性会引起误判，但沙门作为致病菌更应该被监测，所以也算是误打误撞可以一网打尽；

--枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌等革兰氏阳性菌株在TBX琼脂上被完全抑制。

表1：不同标准菌株在TBX琼脂上生长情况

2）模拟实际应用：

      将TBX琼脂应用于样品（含阳性添加）及质控样品的检测，使用平板计数法进行试验，大肠埃希氏菌均呈现出鲜明的蓝绿色，与非目标菌容易区分，观察计数非常轻松。而高污染背景的下水道涂抹（直接划线）和厕所水样品（平板计数法）用TBX琼脂检测时，也能呈现出很好的选择性。

        因此，TBX琼脂无论是标准菌株试验还是模拟实际应用，不仅操作简单、计数简便，其生长率、特异性和选择性都呈现很好的效果。